cjCRISPR/Cas9 ile KÖRLÜK TEDAVİSİ

CRISPR / Cas9 genom düzenleme tekniği ile, Kore'de Temel Bilim Enstitüsü (IBS) içindeki Genom Mühendisliği Merkezi'ndeki bilim adamları, ToolGen ve Seul Ulusal Üniversitesi işbirliği ile şimdiye kadarki en küçük CRISPR / Cas9'u kas hücrelerine ve kas hücrelerine aktardılar.

Adeno-ilişkili virüsler (AAV) vasıtasıyla farelerde körlüğe neden olan bir geni değiştirmek için kullandılar. Yeni, küçük Cas9 enzimini, gıda zehirlenmesinin ortak bir nedeni olan Campylobacter jejuni bakterisinden elde ettiler.

Bu çalışmadan elde edilen bulgular geçenlerde Nature Communications'da " In Vivo Genomic Regulation with Small Cas9 Orthologue Derived from Campylobacter jejuni” Campylobacter jejuni'den Türemiş Küçük Cas9 Ortholog'uyla In Vivo Genom Düzenleme" başlıklı bir makalede yayınlandı.

CRISPR / Cas9 sistemi, bir dizi hastalıkta moleküler terapinin gerçek bir kaynağı olan moleküler biyoloji alanında bütün çalışmaları tetikledi. Bu teknik, genleri düzenlemek için yenilikçi, ucuz ve hassas bir tekniktir - kılavuz RNA tarafından gösterilen hassas noktalarda hedef gen üzerinde kesimler yaratmak için moleküler makas çifti olarak çalışmaktadır. Bununla birlikte, CRISPR / Cas9 kompleksinin hedef DNA'sına ulaşması için plazmidler veya virüsler yoluyla verilmesi gerekir.  

IBS Genom Mühendisliği Merkezi direktörü Jin-Soo Kim, "AAV in vivo ilgi konusu bir geni ifade etmek için etkili ve güvenli bir vektör ve gen terapisinde geniş bir şekilde kullanıldı" dedi. 

Cas9 enzimi çeşitli bakteriler tarafından bir bağışıklık silahı olarak kullanılır-bakterilere zarar verebilecek viral DNA'yı kesmek için kullanılır. CRISPR / Cas9 tekniğinin en yaygın versiyonu, Streptococcus pyogenes bakterisinden türetilen Cas9'u kullanır. Bununla birlikte, bu protein 1368 amino asitten yapılmıştır ve AAV'ye aktarılamayacak kadar büyüktür. Bilim adamları Cas9 enziminin daha küçük versiyonlarını keşfettiler, örneğin Staphylococcus aureus'dan (1053 amino asit) türemiştir. Bununla birlikte, bu sürüm sadece AAV'nin içine sığabilmesine rağmen, diğer önemli proteinler için yeterli alan bırakmaz dediler.

Mevcut araştırmada, araştırma ekibi C. jejuni Cas9'un hem verimli hem de küçük olduğunu keşfettiler. 984 amino asitte, birden fazla kılavuz RNA'yla birlikte AAV içine ve aynı zamanda bir floresan yeşil proteini paketlediler.

Biz elde edilen tarihe karakterize küçük Cas9 ortolog, mevcut Campylobacter jejuni (CjCas9), verimli genom düzenleme için in vivo ," araştırmacılar yazdı."Protospasere bitişik motif (PAM) sekanslarını belirledikten ve tek rehber RNA (sgRNA) uzunluğunu optimize ettikten sonra, hepsi bir arada adeno-ilişkili virüs (AAV) vektöründe CjCas9 genini, sgRNA dizisini ve bir markör geni (GFP) paketledik Ve ortaya çıkan virüs yüksek bir titrede üretilir. CjCas9 son derece spesifiktir ve insan veya fare genomunda yalnızca sınırlı sayıda sit alanı keser. "
 

Gen düzenleme için bakteriyel bir protein kullanmak için, araştırmacılar tekniğin bazı yönlerini optimize etmek zorundaydı. Cas9 tarafından hedeflenen dizinin hemen ardından, protospacer bitişik motifi (PAM) olarak adlandırılan kısa bir DNA sekansı tasarladılar. Her bir farklı Cas9'un belirli bir PAM dizisine ihtiyacı vardır, aksi takdirde hedef DNA dizisine bağlanamaz ve parçalayamaz. Buna ek olarak, kılavuz RNA'nın uzunluğunu değiştirmeleri gerekiyordu.

Değişiklikler tamamlandıktan sonra, araştırmacılar, fare kasları ve gözlerindeki genleri mutasyona uğratmak için yeni CRISPR / Cas9 kompleksini iki rehber RNA ve bir floresan muhabir proteini ile birlikte AAV'ye paketledi.

Bilim adamları yetişkinlerde körlüğün önde gelen nedenlerinden biri olan yaşla ilişkili maküla dejenerasyonunda (AMD) yer alan iki gen üzerinde durdular. Bir gen, ADM için vasküler endotelyal büyüme faktörü A (Vegfa) olarak bilinen yaygın terapötik bir hedeftir, diğeri Vegfa'nın transkripsiyonunu aktive eden bir transkripsiyon faktörüdür ve Hifla olarak bilinir.

Yazarlar "AJA yoluyla verilen CjCas9, fare kas hücrelerinde veya retina pigment epiteli (RPE) hücrelerinde yüksek frekanslarda hedeflenen mutasyonlara neden oluyor" yazdı. "Ayrıca, RPE hücrelerindeki Vegfa veya Hif1a genini hedef alan CjCas9, in vivo olarak CjCas9 ile yapılan düzenlemenin yaşla ilişkili maküla dejenerasyonunun tedavisinde yeni bir seçenek olduğunu düşündüren, lazerle indüklenen koroid neovaskülarizasyon boyutunu azaltmaktadır."

AAV ile paketlenmiş CRISPR / CjCas9'un göz içi enjeksiyonu, çeşitli retinal hastalıkları ve sistemik hastalıkları tedavi etmek için yararlı olabilir "CjCas9 oldukça spesifiktir ve genomda hedef dışı mutasyonlara neden olmaz" diyor Dr. Kim.

Hif1a gen hedef sekansları hem farelerde hem de insanlarda aynıdır; Bu nedenle bu çalışmada sunulan yöntem, insan hastalarında ADM'nin tedavisi için gelecekte kullanılabilir. CjCas9'un, müdahale edilemez genlere veya kodlamayan dizilere karşı uygulanmasına yol açarak, bu teknoloji terapötik hedeflerin aralığını genişletebilir. 
  

Haber 26/02/2017

Prof.Dr.Haydar BAĞIŞ